V poznih osemdesetih letih prejšnjega stoletja, kot je napredovala, pa ima laserska konfokalna mikroskopija veliko napako: konfokalna odprtina ne le blokira fluorescenco, ki nastane zunaj žariščne točke, ampak blokira tudi fluorescenco, ki jo ustvari žariščna točka, ki jo razpršijo biološka tkiva, kar povzroči zmanjšanje učinkovitosti zbiranja fluorescence, globina slikanja pa ne sme biti večja od 100 mikrometrov. Zato se je v devetdesetih letih prejšnjega stoletja pojavila dvofotonska fluorescenčna mikroskopija, ki združuje lasersko konfokalno mikroskopijo in tehnologijo dvofotonskega vzbujanja. Vzbujevalna valovna dolžina procesa dvofotonske absorpcije je na splošno nastavljena v območju biooptičnega okna 680-1080 nm, s čimer se prepreči poškodba ultravijolične svetlobe na celicah ali živih organizmih in prodre globlje.
Trenutno je najpogosteje uporabljen dvofotonski fluorescenčni mikroskop femtosekundni titanov laser za drage kamne, ki je zajeten in drag, kar omejuje uporabo dvofotonske fluorescenčne mikroskopije na različnih področjih, kot so znanosti o življenju, kemija in medicina. Tako so na nekaterih področjih, kot je medicinska diagnostika, ljudje poskušali uporabiti kompaktne in cenovno dostopne sub-nanosekundne polprevodniške laserje kot standardni vir svetlobe.
Osnovno načelo dvofotonskega vzbujanja je, da ko je fluorescentna molekula vzbujena pri visoki gostoti fotonov, hkrati absorbira dva fotona z dolgimi valovnimi dolžinami in nato spontano seva fluorescenčne fotone nazaj v osnovno stanje po skokih vzbujanja in relaksacijskih procesih. V primerjavi s konvencionalno enofotonsko vzbujevalno fluorescenčno mikroskopijo je generiranje optičnega signala pri dvofotonski vzbujevalni fluorescenčni mikroskopiji nelinearno, pri čemer je vzbujevalna svetloba vir svetlobe z daljšo valovno dolžino in večjo konično močjo, oddani fluorescenčni fotoni pa imajo valovno dolžino nekoliko daljši od polovice valovne dolžine vzbujanja.
Dvofotonska fluorescenčna mikroskopija uporablja skoraj infrardeči laserski svetlobni vir, njena nelinearna narava pa ne zahteva konfokalne odprtine. Zato ima dvofotonska fluorescenčna mikroskopija v primerjavi s konfokalno mikroskopijo naslednje prednosti:
- Velika globina slikanja in majhna optična poškodba;
- Konfokalna odprtina ni potrebna, učinkovitost zbiranja fluorescence pa je močno izboljšana;
- Višja prostorska ločljivost in kontrast;
- Majhno območje vzbujanja, majhna fototoksičnost in beljenje;
- Emisijska in vzbujevalna valovna dolžina sta daleč narazen, kar preprečuje spektralno prekrivanje;
